13、為何出現(xiàn)鬼峰
①進(jìn)樣閥殘余峰－－每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗；
②樣品中未知物－－處理樣品；
③柱未平衡－－重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑（尤其是離子對色譜）；
④三氟乙酸（TFA）氧化－－每天新配,用抗氧化劑；
⑤水污染（反相）－－通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量，用HPLC級的水。
14、為何出現(xiàn)峰拖尾
①柱超載－－降低樣品量，增加柱直徑采用較高容量的固定相；
②峰干擾－－清潔樣品，調(diào)整流動相；
③硅羥基作用－－加三乙胺，用堿致鈍化柱，增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相pH值，純化樣品；
④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效－－更換燒結(jié)不銹鋼，加在線過濾器，過濾樣品；
⑤柱塌陷或形成短路通道－－更換色譜柱，采用較弱腐蝕性條件；
⑥死體積或柱外體積過大－－連接點降至最低，對所有連接點作合適調(diào)整，盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管；
⑦柱效下降－－用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱。
15、除了流速外，還有哪些因素能引起壓力改變
改變流動相組成和溫度；改變柱長、柱內(nèi)徑和填料粒度；柱突然阻塞壓力升高（正常情況下其它條件不變柱壓都是逐漸升高的）。
16、什么是強(qiáng)溶劑、弱溶劑
改變流動相的組成或溶劑溶劑強(qiáng)度就可以改變峰容量因子和保留時間。在一定條件下，減少保留時間或縮短分析時間的溶劑為強(qiáng)溶劑，增加保留時間或延長分析時間的溶劑為弱溶劑。
17、怎樣才會使峰位發(fā)生重排
在分析多組分樣品時，僅改變流動相的強(qiáng)度（組成百分比）而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的保留時間，不會發(fā)生峰位的重排。
下列條件改變可能發(fā)生峰位重排：流動相中換了強(qiáng)溶劑；pH值的改變；柱填料的改變；柱溫的改變；流動相的組成改變（如，加入離子對試劑三乙基胺等）。
18、除了在線脫氣，常用的實驗室脫氣方式還有哪些
加熱回流脫氣，脫氣效果最佳，但無法保持；氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價格太貴，所以用的不多；真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失；超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實驗室中最常用。目前還是盡量爭取用在線脫氣，方便且效果好。
19、評價一個色譜柱的最基本指標(biāo)有那些
評價一根色譜柱的基本指標(biāo)是：塔板數(shù)、峰不對稱因子、柱壓降、適用范圍和鍵合相濃度以及峰容量。
20、為何出現(xiàn)峰展寬
①樣品體積過大－－用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% ；
②在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展－－進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散 ；
③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢－－設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點 ；
④檢測器時間常數(shù)過大－－設(shè)定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10% ；
⑤流動相粘度過高－－增加柱溫,采用低粘度流動相；
⑥檢測池體積過大－－用小體積池,卸下熱交換器；
⑦保留時間過長－－等度洗脫時增加強(qiáng)溶劑含量,也可用梯度洗脫；
⑧柱外體積過大－－將連接管徑和連接管長度降至最小；
⑨樣品過載－－進(jìn)小濃度小體積樣品。
21、色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理
HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下（不包括梯度），峰型應(yīng)對稱而尖銳。但是，在對樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理下，會出現(xiàn)各種意想不到的問題，而對色譜峰難以作出合理的解釋，尤其對于新手更是如此。色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì)，但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，而表明含二種物質(zhì)。出現(xiàn)這種情況分為四種原因。
1)色譜柱
如果你分析樣品時發(fā)現(xiàn)每個色譜峰都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質(zhì)時，可以肯定色譜柱出問題－柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進(jìn)樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖，正沖有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這是可以將進(jìn)樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應(yīng)柱效很低而報廢。
2)溶劑極性及進(jìn)樣量
許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的 HPLC的書籍和文獻(xiàn)都不會提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰�。看味疾惶粯樱�，且拖尾，保留時間會提前（相對進(jìn)樣量少而言），將進(jìn)樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎！＿@是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個原因，另一個原因是，進(jìn)樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了，這是由于進(jìn)樣量過大，色譜柱過載造成的。
3)樣品的特性
有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無法分開，而是以一個動態(tài)平衡存在。在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如，紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC-MS下，用質(zhì)譜檢測器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯，例如，我分析過的農(nóng)藥啶蟲瞇（吡蟲清）。
4)參數(shù)
記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的，例如，C－R3A數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2ms，HPLC為5ms，如果記錄間隔時間縮短，一個峰將變?yōu)槎䝼�峰或更多。
22、為什么在實驗過程中有時會出現(xiàn)倒峰
所用的流動相在檢測波長下有吸收，而進(jìn)在此波長下沒有吸收或吸收低于流動相的溶液，在流動相中會出現(xiàn)洞穴，通過柱后出現(xiàn)倒峰。
23、為何會出現(xiàn)“胖”峰和平頭峰，怎樣避免
用比流動相強(qiáng)度大的大體積樣品進(jìn)樣，通常會損害色譜圖的質(zhì)量，而出現(xiàn)“胖”峰和平頭峰。應(yīng)遵循下列規(guī)則選用溶劑溶解樣品：A最好用流動相溶解樣品進(jìn)樣。B用大體積弱溶劑溶解樣品，如反相色譜中用水溶解樣品進(jìn)樣，主要缺點是每次進(jìn)樣后在色譜圖的開頭出現(xiàn)大的負(fù)峰，有時還波及到樣品峰。C需要時用強(qiáng)溶劑溶解進(jìn)樣。
24、前延峰的發(fā)生及處理
因柱溫問題很易引起前延峰，有些樣品在常溫下分離可見前延峰，提高溫度后前延峰的現(xiàn)象消失。在離子對色譜中，前延峰的另一個原因是用非流動相作樣品溶劑。因此在離子對色譜中要求僅用流動相溶解樣品，而且進(jìn)樣量不要太大，否則會導(dǎo)致前延峰或其它問題。在RP-HPLC中樣品溶液的強(qiáng)度大于流動相引起前延峰。增加流動相的強(qiáng)度，減少樣品溶液的強(qiáng)度，在離子對色譜中增加離子強(qiáng)度，可以克服前延峰的效應(yīng)。此外使用流動相溶解樣品是解決的最簡單實用的方法。
25、如何簡單判斷比例閥是否內(nèi)漏
設(shè)定泵使用一個單獨通路（A），打開Purge閥，流速5mL/min，提起其他溶劑瓶內(nèi)的溶劑過濾頭直至離開液面，觀察這些通路（B、C、D）內(nèi)的溶劑是否隨著流動，正常時均不應(yīng)流動。
26、峰變寬的原因
A在使用過程中柱本身退化，逐漸降低柱效。
B柱外峰寬效應(yīng)。一根很好的專用柱用于另一液相色譜系統(tǒng)引起塔板數(shù)降低，說明新系統(tǒng)有很大的柱外峰寬效應(yīng)。
C化學(xué)效應(yīng)，多數(shù)是流動相和固定相相互作用所致，改變流動相可使寬峰有所改善。
27、柱平衡慢的常見原因
柱平衡慢的常見原因是，組分在舊的或新的流動相中對柱吸附強(qiáng)，或者在新的流動相中濃度小甚至為零。A流動相含有胺改良劑；B流動相含有離子對試劑；硅膠柱；流動相中有四氫呋喃�？煽紤]采用專用柱用于特殊的方法，不用時將柱折下來，注滿適當(dāng)?shù)娜軇┗蛄鲃酉�，密封保管，不再作其它的分析�?/p>
28、對內(nèi)標(biāo)物的要求有哪些
A.內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)或理化性質(zhì)應(yīng)與被分析組分相似或相近；
B.內(nèi)標(biāo)物的保留值應(yīng)稍大于或小于被分析物的保留，不能相差過大；
C.內(nèi)標(biāo)物的峰要與所有被分析物的峰有良好的分離度（R大于1.5），不能讓內(nèi)標(biāo)物成了干擾物；
D.無結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)標(biāo)物，可用保留相近的內(nèi)標(biāo)物；E儀器對分析物的響應(yīng)與內(nèi)標(biāo)基本一致，出峰面積大小不能相差懸殊。
29、什么是HPLC的“無限直徑效應(yīng)”
在HPLC分析中由于使用了高效微粒固定相及高壓流動相，樣品以柱塞式注入色譜柱后，因柱的阻力大，樣品分子在柱中的分子擴(kuò)散很小，直至它從色譜柱流出也未與色譜柱內(nèi)壁接觸，因而引起的色譜峰形擴(kuò)展很小，能保持高柱效。
30、如何評價一臺檢測器
A.噪聲：通常噪聲是指由儀器的電氣元件、溫度波動、電壓的線性脈沖以及其他非溶質(zhì)作用產(chǎn)生的高頻噪聲和基線的無規(guī)則波動；
B.基線飄移：漂移是基線的一種向上或向下的緩慢移動，可在較長時間（0.5~1h）內(nèi)觀察到。它可掩蔽噪聲和小峰。漂移與整個液相色譜系統(tǒng)有關(guān)，而不僅是由檢測器引起的；
C.靈敏度（最小檢出濃度或最小檢出量）：在一個特定分離工作中，檢測器是否有足夠的靈敏度是十分重要的。當(dāng)比較檢測器時，常使用敏感度這一性能指標(biāo)。敏感度，即指信號與噪聲的比值（信噪比）等于2時，在單位時間內(nèi)進(jìn)入檢測器的溶質(zhì)的濃度或質(zhì)量；
D.線性范圍：在進(jìn)行定量分析時，希望檢測器有寬的線性范圍，以便在一次分析中可同時對主要組分和痕量組分同時進(jìn)行檢測；
E.檢測器的池體積：它應(yīng)小于最早流出的死時間色譜峰的洗脫體積的1/10，否則會產(chǎn)生嚴(yán)重的柱外譜帶擴(kuò)展。
相關(guān)閱讀：
