一、流動相的選擇
1、流動相的混合
雙泵主要是在探討流動相的配比或者梯度洗脫是比較方便，知道確切的液相色譜儀條件時，建議配好后使用的話，混合比較均勻，效果較好。
2、脫氣
HPLC所用流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。
系統(tǒng)中氣泡的產(chǎn)生：流動相本身存在，梯度淋洗混合后放出氣泡；
氣泡的影響：存在于管路中，系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定，實驗結(jié)果有偏差；
存在于單向閥中，易造成液體回流，流量不準(zhǔn)確，甚至是不吸液；
存在于檢測器中，出現(xiàn)鬼峰，影響檢測準(zhǔn)確性。
所以做液相對流動相的氣泡和雜質(zhì)要求比較嚴(yán)格。氣泡會影響柱的分離效率，檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結(jié)果帶來誤差�！ �
溶解氧能與某些溶劑（如，甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導(dǎo)致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現(xiàn)象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應(yīng)用中的靈敏度。
常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發(fā)造成的組成變化。
（1）氦氣脫氣：氦氣脫氣是很有效的脫氣方法。氦氣緩緩的通過流動相趕去溶入的空氣，如果使用得當(dāng)，在10min內(nèi)可除去80%～90%的溶入氣體。由于氦氣在流動相中的溶解度極低，所以用氦氣脫氣保護的流動相可以認(rèn)為是一個無氣體溶解體系。其缺點是氦氣價格比較昂貴，會增加檢驗成本。一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測時經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
（2）真空脫氣：也是比較常用的脫氣方法。現(xiàn)在多數(shù)企業(yè)都最常用這種辦法，貯液器被抽成部分真空，溶入的氣體蒸發(fā)形成氣泡溢出，其效果僅次于氦氣脫氣。象Agileng1200液相色譜使用的是在線脫氣機。在線脫氣只適合脫完氣之后的流動相，在使用過程中的微量脫氣。
（3）超聲波脫氣：將配制好的流動相連容器放入超聲水槽中脫氣10～20min。這種方法比較簡便，又基本上能滿足日常分析操作的要求，所以，目前仍廣泛采用。這種方法只能除去30%的溶解氣體，有時還會引起氣體溶解度的增加。對氧敏感的檢測器不宜用此法。
超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），關(guān)于超聲時間問題眾說紛紜，各實驗室內(nèi)5～30分鐘不等，一般來說流動相組成為無機（緩沖鹽溶液）時，5～15分鐘即可，流動相為是水和有機容積混合時，超聲時間要相對長一些，這個方法只能除去30%的溶解氣體，時間的延長不和效果成正比，且其中氣泡對色譜峰基線穩(wěn)定性與信噪比有一定影響，一般來說影響不大，15min超聲即可足夠。此法不影響溶劑組成。超聲時應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。
（4）加熱回流脫氣：該方法雖然效果很好，但是適用范圍較窄。對于有機溶劑或混合流動相不適合用此法，因為揮發(fā)性組分會損失掉，改變流動相的組成。
綜合來說，用真空抽濾后，再用超聲脫氣還是最常用的辦法，用氦氣的方法是效果最好的辦法，而在線脫氣本身也是真空脫氣，但它可以放到儀器上使用，是一種保證性的辦法。
A.離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。
B.在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無此缺點。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。
注：
1.選用流動相配置對色譜峰影響最小
2.流動相溶解度達(dá)不到要求時，盡量選用流動相中含有的比例較大的成分，以減輕進(jìn)樣對流動相的影響造成基線不穩(wěn)。
3.流動相組成溶劑均達(dá)不到要求時，選取的溶劑應(yīng)保證在設(shè)定波長內(nèi)無紫外吸收。
二、流動相的PH
如需在一定PH值下操作，須定期測定流動相的PH值，大氣中的CO2溶解在流動相內(nèi)將引起PH值的改變，特別是貯液瓶密閉不嚴(yán)時這種影響可能更大。
三、更換柱子及流動相
軟質(zhì)或半軟質(zhì)填料的溶脹率隨溶劑極性的變化而變化，使用新柱時應(yīng)先用25~30倍柱容積的合適流動相平衡。更換流動相時，如果兩種流動相不互溶，需采用過渡溶劑使前一種流動相逐步溶解除去。例如，2、2、4-三甲基戊烷換成甲醇時，必須用乙酸已酯或其他溶劑過渡，直到標(biāo)準(zhǔn)物保留值達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。
（內(nèi)容來源實驗與分析網(wǎng)）
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