液相色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)，封尾技術(shù)和裝柱技術(shù)等。
一、色譜填料技術(shù)
填料的差異對色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響，色譜填料的鍵合相密度的不同也會(huì)影響到填料表面硅羥基裸露的多少，進(jìn)而影響填料的選擇性。
1、填料分類及方法
填料分為濕法填充和干法填充，資料顯示在正常條件下，填料粒度＞20μm時(shí)，干法填充制備柱較為合適，顆粒＜20μm時(shí)，濕法填充較為理想。
填充方法一般有4種：
①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；
②徑向加壓法；
③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱，如DAC；
④干法柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。
2、色譜柱填料粒徑
在色譜分析工作中，該怎么選擇色譜柱的中填料的粒徑呢？目前市場上主要可供選擇的分析用填料粒徑主要有以下幾種：
①1.7μm、1.8μm、 2.2μm-----快速液相色譜柱：匹配快速色譜儀
②3.0μm、3.5μm-----快速液相色譜柱：普通快速分析
③5μm-----常規(guī)分析
其中5μm的粒徑是最常用的，但是這里是指平均粒徑是5μm，也有可能有3μm和5μm粒徑的填料。當(dāng)然色譜填料的粒徑越小，理論塔板高度越低，相應(yīng)的柱效越高，分離度和靈敏度就越好，而且在高線速度區(qū)域，柱效的降低也得于緩和，但是壓力會(huì)成倍上升。通常我們會(huì)結(jié)合色譜柱的長度來綜合選擇色譜柱的粒徑，長度和粒徑都是用來改變柱效的，選擇原則是夠用就好。當(dāng)待分離物質(zhì)≤5個(gè)時(shí)，150mm柱長的色譜柱可以滿足大多數(shù)樣品的分離。
3、色譜填料的孔徑和比表面積
現(xiàn)在多孔填料的 95%以上表面積在孔內(nèi)部，這樣只有分析目標(biāo)物進(jìn)入孔內(nèi)，才能達(dá)到分析分離的目的。而只有樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進(jìn)入微粒內(nèi)部。對于小分子的反相分離，選擇小孔徑（60Å ~120Å）填料柱，對于小分子和多肽使用100Å~150Å，而只有當(dāng)目標(biāo)物的分子量大于2000 時(shí)我們才會(huì)選擇300Å孔徑的填料。如藥典上介紹測定分子量大于2000的樣品，選擇柱子填料的孔徑為300Å，因?yàn)樵谧龆嚯念悩悠返臅r(shí)候，300Å孔徑的填料相對100Å孔徑肯定要選擇性好點(diǎn)，也就是分離度相對比較好點(diǎn)。因?yàn)榈鞍追肿恿浚?/span>2000，會(huì)對進(jìn)入120Å填料的孔造成困難，從而進(jìn)不了孔，沒有保留，就在填料表面，隨著溶劑一同出峰。我們一般選擇填料的時(shí)候，要求孔徑至少是分子直徑的三倍，從而保證分子可以進(jìn)入到孔內(nèi)。
每克填料的比表面積與孔徑和粒徑有關(guān)，隨著孔徑的增加，比表面積降低。目前比表面積一般為：180m2/g-350m2/g，隨著比表面積增大，保留增加，載樣量增加，平衡時(shí)間增加（梯度洗脫尤為注意）。我們在日常色譜分析工作中可根據(jù)需要選擇合適的比表面積。
二、色譜封尾技術(shù)
什么是色譜柱的封尾？由于空間位阻的存在，鍵合反應(yīng)最多只能覆蓋 50%的硅羥基，超過一半硅羥基是活性硅羥基，與堿性基團(tuán)會(huì)發(fā)生離子交換作用，增加了保留，導(dǎo)致峰形拖尾，用短鏈氯硅烷（如三J基氯硅烷）鍵合活性的硅羥基，可以減小這種影響，這種操作被稱為封尾，或稱為封端、封口。
封尾與不封尾的色譜填料有什么區(qū)別呢？封尾消弱硅羥基作用，不封尾提高硅羥基影響，增強(qiáng)極性物質(zhì)的保留，降低柱流失，但是有些物質(zhì)會(huì)在不封尾的柱子上產(chǎn)生拖尾。
封尾技術(shù)中用到的封尾試劑的差異也會(huì)對色譜柱的性質(zhì)產(chǎn)生很大的影響，如體現(xiàn)在色譜填料的pH耐受范圍，水相耐受范圍，極性強(qiáng)弱等。
三、色譜裝柱技術(shù)
裝柱技術(shù)也沒有想象中的這么簡單，不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長度，裝柱工藝都有所不同，要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床，需要經(jīng)驗(yàn)積累。
