一、概述
在水凈化和污水處理領(lǐng)域，大腸桿菌用于檢查水源是否被糞便污染的標(biāo)志，其測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)為大腸菌群指數(shù)。
細(xì)菌是單細(xì)胞的原核生物。細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等。細(xì)菌無(wú)成型的細(xì)胞核，細(xì)胞壁由肽聚糖組成。由于細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，細(xì)菌可分為革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌兩類。革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁厚，無(wú)莢膜，多產(chǎn)生外毒素；革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁薄，有莢膜，多產(chǎn)生內(nèi)毒素。革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)青霉素更為敏感。
大腸桿菌是革蘭氏陰性、異養(yǎng)兼性厭氧型腸道桿菌。在腸道中一般對(duì)人無(wú)害，但任何大腸桿菌進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)，都會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。大腸桿菌在基因工程技術(shù)中被廣泛的應(yīng)用，它的質(zhì)粒是最常用的運(yùn)載體，它也是基因工程中常用的受體細(xì)胞。
二、應(yīng)用說(shuō)明
1、應(yīng)用儀器
電子分析天平、ph計(jì)、油浴鍋、滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱
2、培養(yǎng)基配置
微生物生命活動(dòng)過(guò)程中需要的化合物有碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生長(zhǎng)因子是微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物，但不一定需要外界補(bǔ)充，有的微生物可以自身合成。在提供上述幾種主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。
我們一般用LB液體培養(yǎng)基來(lái)擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后可在LB固體培養(yǎng)基上劃線分離。以下為本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基配置步驟：
1．稱量：準(zhǔn)確稱取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50ml。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需加1g瓊脂。
2．溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到50mL。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需加瓊脂，整個(gè)過(guò)程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。
3．調(diào)pH：用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至偏堿性。
4．滅菌：在兩個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50ml LB液體培養(yǎng)基和50ml LB固體培養(yǎng)基，加上棉塞。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內(nèi)，1kg壓力滅菌15min。
5．倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至60℃左右時(shí)在酒精燈火焰附近操作進(jìn)行。其過(guò)程是：
①將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；
②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過(guò)火焰；
③用左手將培養(yǎng)皿打開(kāi)一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋；
④待平板冷卻凝固后，將平板倒過(guò)來(lái)放置。 倒過(guò)來(lái)放置的目的是防止培養(yǎng)基冷卻過(guò)程中形成的水滴落到培養(yǎng)基表面。向培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移已滅菌的培養(yǎng)基時(shí)，也不要把培養(yǎng)基沾在皿壁上。否則，空氣中雜菌會(huì)在這些粘附培養(yǎng)基上繁殖，并污染皿內(nèi)培養(yǎng)基。
三、細(xì)菌的分離
1．劃線分離法
用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線過(guò)程中菌液逐漸減少，細(xì)菌也逐漸減少。劃線到最后，可使細(xì)菌間的距離加大。在培養(yǎng)10～20h后，可由一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生單菌落，菌落不會(huì)重疊。如果再將每個(gè)菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個(gè)斜面的菌群就是由一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生的后代。
其操作步驟是：將培養(yǎng)皿底部用拇指和無(wú)名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開(kāi)。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線 3～5條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，用燒過(guò)冷卻的接種針，通過(guò)第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時(shí)，接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。
取菌種前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進(jìn)行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環(huán)的目的是防止細(xì)菌污染環(huán)境和操作者。
2．涂布分離法
先將培養(yǎng)的菌液稀釋，通常稀釋到10－5 ～10－7之間，然后取0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進(jìn)行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)南♂尪认�，可產(chǎn)生相互分開(kāi)的菌落。通常每個(gè)培養(yǎng)皿有20個(gè)以內(nèi)的單菌落最為適合。將每個(gè)菌落分別接種在斜面上擴(kuò)增培養(yǎng)后，再做功能性實(shí)驗(yàn)。
劃線分離法，方法簡(jiǎn)單；涂布分離法，單菌落更易分開(kāi)，但操作復(fù)雜些。細(xì)菌的兩種分離法各有優(yōu)點(diǎn),都可采用。
四、菌落和菌種種類的辨認(rèn)
單個(gè)細(xì)菌用肉眼是看不見(jiàn)的，但是，當(dāng)單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，便會(huì)形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。不同種類的細(xì)菌所形成的菌落在大小、形狀、顏色、光澤度、透明度等方面具有一定的特征。
細(xì)菌的菌落表面一般是光滑而濕潤(rùn)的，有黏稠性，多數(shù)透明或半透明，但也有細(xì)菌的菌落表面是干燥、有褶皺的；放線菌由于有纖細(xì)的菌絲并可產(chǎn)生孢子，所以菌落表面是緊密的絨狀、堅(jiān)實(shí)多皺，長(zhǎng)孢子后就成粉末狀，由于菌絲和孢子有多種色素，所以在菌落培養(yǎng)基底部和菌落表面都有不同的顏色，菌落不易用接種環(huán)挑動(dòng)；酵母菌落類似于細(xì)菌菌落，表面光滑而濕潤(rùn)，有黏稠性但大多呈乳白色，少數(shù)呈紅色。
如果菌落無(wú)法辨認(rèn)，只有借助于顯微鏡觀察。在顯微鏡下細(xì)菌一般為桿狀、球狀和弧狀，直徑都在1um左右；放線菌菌絲是沒(méi)有橫隔的分枝絲狀體，氣生菌絲頂端分裂成串狀孢子，孢子絲有直線形、螺旋狀、彎曲式或輪生等；酵母有卵圓型或絲狀，但卵圓形細(xì)胞大于細(xì)菌，直徑約5~7um。
五、注意事項(xiàng)
應(yīng)用檢測(cè)過(guò)程要注意滅菌和消毒，具體如下：
1．無(wú)菌技術(shù)：
①對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；
②將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；
③為避免周?chē)⑸镂廴�，�?shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行；
④避免已滅菌處理的材料用具與周?chē)奈锲废嘟佑|。
2．消毒方法：
①日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法；
②對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法；
③對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用紫外線進(jìn)行物理消毒；
④實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒。
3．滅菌方法：
①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；
②培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；
③表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。
4．比較消毒和滅菌：
比較項(xiàng) 理化因素的作用強(qiáng)度 消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅
消毒 較為溫和 部分生活狀態(tài)的微生物不能
滅菌 強(qiáng)烈 全部微生物能
5．其他注意事項(xiàng)：
①實(shí)驗(yàn)中用的棉花不能用脫脂棉，因脫脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。滅菌后，通常在60～80℃烘箱中除去滅菌時(shí)的水分；
②物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開(kāi)排氣閥，煮沸并排除鍋內(nèi)冷空氣，其目的是有利于鍋內(nèi)溫度升高，隨后關(guān)閉排
氣閥繼續(xù)加熱，加熱結(jié)束切斷熱源后，要使溫度自然降低，氣壓務(wù)必降至零時(shí)打開(kāi)鍋蓋，其目的是防止容器中的液體暴沸；
③在用任何器皿轉(zhuǎn)接時(shí)，瓶塞和封口膜只能夾在手上，不許放在臺(tái)面上，接種時(shí)要在酒精燈火焰旁操作；
④培養(yǎng)基一定不能沾在三角瓶口、試管管口和培養(yǎng)皿壁上，否則容易污染；
⑤接種時(shí)要膽大心細(xì)，動(dòng)作快捷，這是減少污染的關(guān)鍵；
⑥接種后，培養(yǎng)皿必須倒放（蓋在下方）在恒溫培養(yǎng)箱中，如正放則水蒸氣在蓋上凝成水滴，滴到接種后的培養(yǎng)基表面，
水流擴(kuò)散會(huì)使菌落擴(kuò)散，就很難形成單菌落了。
