一、方法原理
樣品經(jīng)高氯酸提取，固相萃取、純化、濃縮，微孔濾膜過(guò)濾后，直接進(jìn)樣。用反相色譜分離，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。出峰順序?yàn)橥撩顾�、四環(huán)素、金霉素。
二、主要儀器設(shè)備
三、試劑
- 乙腈：色譜級(jí)
- 磷酸二氫鈉溶液：0.01mol/L，pH=2.5
- 土霉素、四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：土霉素、四環(huán)素1mg/mL，金霉素1mg/mL，甲醇為溶劑
- 土霉素、四環(huán)素、金霉素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：土霉素、四環(huán)素0.05～1μg/mL，金霉素0.2～2μg/mL，流動(dòng)相為溶劑
- 高氯酸溶液：1%和0.5%
- 甲醇：分析純
- 乙二胺四乙酸二鈉溶液：5%
- 正己烷：分析純
四、操作步驟
1、樣品處理
魚(yú)去鱗、去皮沿背脊取肌肉；蝦去頭、去殼取可食肌肉部分；蟹、甲魚(yú)等取可食部分；樣品切為0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊后混勻。
稱取5g精確到0.001g樣品，置于50mL離心管中，加入1%高氯酸溶液10ml，用均質(zhì)器均質(zhì)30s，于振蕩器上振蕩提取3min，以4000r/min離心10min，取上層清夜于50mL試管中，向離心管中的殘?jiān)偌尤?.5%的高氯酸溶液5mL，重復(fù)操作一次，合并上清液。加入1mL正己烷，振蕩1min后離心，除去正己烷相，再加入1mL正己烷，重復(fù)操作一次。
用5mL甲醇、2mL5%乙二胺四乙酸二鈉溶液、5mL水活化ODS-C18柱。接著將上述水相清液上樣。用10mL蒸餾水洗去雜質(zhì)，以5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40℃水浴中氮?dú)獯蹈桑约状级ㄈ葜?mL，以0.45μm濾膜過(guò)濾。濾液備用。
2、色譜參考條件
2. 1.色譜柱：ODS-C18
2. 2.柱溫：37℃
2. 3.檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm
2. 4.流動(dòng)相：乙腈-磷酸二氫鈉溶液22:78
2. 5.流速：1mL/min
2. 6.進(jìn)樣量：20μL
3、工作曲線
在上述工作條件下，分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液各20μL進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。色譜圖如下，出峰順序依次為土霉素、四環(huán)素和金霉素。
4、樣品測(cè)定
取樣品濾液20μL進(jìn)樣，記錄峰面積，從工作曲線算得土霉素、四環(huán)素、金霉素的含量。
5、結(jié)果計(jì)算
樣品中土霉素、四環(huán)素、金霉素的含量按下式進(jìn)行計(jì)算：
X=c×V/m
式中：
X——樣品中抗生素的含量，單位為毫克每千克mg/kg；
c——樣品溶液中抗生素含量，單位為微克每毫升μg/mL；
m——樣品的質(zhì)量，單位為克g；
V——樣品溶液體積，單位為毫升mL；
計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。
6、方法回收率
本方法的回收率≥70%。
7、方法檢測(cè)限
本方法的檢測(cè)限：土霉素≤0.05mg/kg，四環(huán)素≤0.05mg/kg，金霉素≤0.1mg/kg。出峰順序依次為土霉素、四環(huán)素和金霉素。
