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本方法適用于鮮活水產(chǎn)品及其制品中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠的檢驗。

一、方法原理    

試樣中殘留的孔雀石綠經(jīng)乙腈-乙酸鹽酸緩沖混合液提取后，經(jīng)乙腈再次提取，液液分配到二氯甲烷層并濃縮，經(jīng)酸性氧化鋁柱凈化后，高效液相色譜—二氧化鉛柱后衍生測定，外標(biāo)法定量。

二、主要儀器設(shè)備            

1. 上海儀電分析高效液相色譜儀LC210，帶紫外檢測器

2.電子天平FA2004

3.超聲波水浴

4.電熱恒溫水浴鍋

5.勻漿機

6.離心機：4 000 r/min。 

7.固相萃取裝置 

8.25% PbO2氧化柱：臨用前用甲醇沖洗，并將PbO2氧化柱連接在紫外-可見檢測器

液相色譜柱之間  

9.酸性氧化鋁柱：1g/3mL，使用前用5 mL乙腈活化

三、試劑

1.乙腈：色譜純

2. 二氯甲烷：分析純 

3. 甲醇：色譜純

4. 乙酸鹽緩沖液：準(zhǔn)確稱取4.95g 無水乙酸鈉及0.95g對-甲苯磺酸，溶解于950mL水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)溶液pH至4.5， 最后用水稀釋到1L。 

5. 20%鹽酸羥胺溶液。 

6. 對-甲苯磺酸溶液1.0 mol/L：準(zhǔn)確稱取17.2g對-甲苯磺酸，置于100mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，混勻。 

7.乙酸銨緩沖溶液50 mmol/L：準(zhǔn)確稱取3.85g無水乙酸銨，置于1000mL容量瓶中，用冰乙酸調(diào)pH到4.5。

8.孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量的孔雀石綠，用乙腈配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。準(zhǔn)確吸取1mL 100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100mL棕色容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，混勻，該標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1μg/mL，于-18℃避光保存。

9.孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取0.5mL 1μg/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL棕色容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，混勻，此標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為20ng/mL，于-18℃避光保存。 

四、操作步驟

1、樣品制備

1.1提取

準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品于50 mL離心管內(nèi)，加入1.5 mL 20%的鹽酸羥胺溶液、2.5 mL 1.0 mol/L的對-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸鹽緩沖溶液，用勻漿機以10 000 r/min的速度均質(zhì)30秒，再加入10 mL乙腈劇烈震搖30 秒。加入5g酸性氧化鋁，再次震蕩30 秒。以 3 000  r/min離心10 min。將上層清液轉(zhuǎn)移至裝有10 mL 水和2 mL 二甘醇的100 mL離心管中，并加入10 mL乙腈，重復(fù)上述操作，合并乙腈層。

1.2凈化 

在離心管中加入15 mL 二氯甲烷,振蕩10 秒，3 000 r/min離心10 min， 將二氯甲烷層轉(zhuǎn)移至100 mL的梨形瓶中，再用5 mL乙腈、10 mL 二氯甲烷重復(fù)上述操作一次，合并二氯甲烷層，收集于100 mL梨形瓶中。45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL，用2.5 mL乙腈溶解殘渣。 

將酸性氧化鋁柱安裝在固相萃取裝置上，將梨形瓶中的溶液轉(zhuǎn)移到固相萃取柱上，再用乙腈洗滌瓶兩次，每次2.5 mL，將洗滌液依次通過酸性氧化鋁柱，控制流速不超過0.6mL/min，收集全部流出液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，準(zhǔn)確加入0.5 mL乙腈溶解，過0.45μm 濾膜，濾液供液相色譜測定

2、高效液相色譜儀參考條件

色譜柱：C18 4.6 mm(i.d)×250mm，在C18色譜柱和檢測器之間連接二氧化鉛氧化柱；

流動相：乙腈+乙酸銨緩沖溶液(60+40)

流速：1 mL/min；

柱溫：室溫

波長：618 nm；

測定：取相同體積試樣制備液和標(biāo)準(zhǔn)使用液分別注入高效液相色譜儀，根據(jù)保留時間按定性，外標(biāo)峰面積法定量。

3、結(jié)果計算

試樣中孔雀石綠的殘留量按下式進行計算，計算結(jié)果需扣除空白值。

X=（C*A*V）/(W*A_s )

  式中：

 X——樣品中孔雀石綠的殘留量，單位為mg/kg；

C——孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度，單位為ug/mL；

 A——樣品中孔雀石綠的峰面積；

A_s——孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液的峰面積；

V——樣液最終定容體積，單位為毫升mL

W——最終樣液所代表的試樣量，單位為g；

   本方法孔雀石綠的殘留量測定結(jié)果系指孔雀石綠和它的代謝物隱色孔雀石綠殘留量的之和，以孔雀石綠表示

4、備注：

參考色譜圖：

1. 10ng/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液

    

2. 20ng/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液