摘要
本文比較分析了國內(nèi)外李斯特菌的檢測方法、不同標(biāo)準(zhǔn)限量值的差異。介紹了國內(nèi)外李斯特菌快速檢測技術(shù)的應(yīng)用及存在的問題，對我國微生物快速檢測的現(xiàn)狀進行了概述，探討了李斯特菌快速檢測技術(shù)的未來發(fā)展方向，對李斯特菌檢驗方法探索及快速檢測技術(shù)的發(fā)展具有一定的借鑒意義。
一、李斯特菌介紹
李斯特菌（Listeria spp.）廣泛存在于環(huán)境中，并且在很多食品有檢出，該菌在低溫的條件下仍能存活和增殖，其中單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是食源性疾病的主要致病菌之一，也是食品安全控制的重要病原體，感染后會造成不同程度的人員死亡，受到各國的高度重視。傳統(tǒng)方法檢測費時費力而靈敏性較差，因此，快速、高效、靈敏可信的檢測方法能夠更加有效判定李斯特氏菌污染風(fēng)險并且控制其危害。
二、李斯特菌的污染及危害
李斯特菌在環(huán)境中普遍存在，也是污染食品的主要病原菌，往往侵染肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等食品。其中，單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是食源性疾病的重要病原菌， WHO將其列為21世紀(jì)四大食源性致病菌之一。單核細胞增生李斯特氏菌廣泛存在于土壤、人和動物的糞便中，在4℃的環(huán)境中仍能生長繁殖，是冷藏食品中主要的病原菌之一，往往污染食品導(dǎo)致食源性疾病的暴發(fā)。近年來，單核細胞增生李斯特氏菌引起的食源性疾病事件時有發(fā)生，并造成不同程度的人員死亡，受到各國的高度重視。
三、國內(nèi)外李斯特菌限量規(guī)定
李斯特菌極容易污染食品，其中冷藏食品和即食食品危害最為嚴(yán)重，各國均制定了食品中李斯特菌的限量值和監(jiān)測計劃。美國對即食食品中單增李斯特菌的限量規(guī)定為0/25g，并要求企業(yè)實施GHP和HACCP。中國大陸2013年頒布的《食品中致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)GB29921-2013》中規(guī)定，在即食肉制品中，單增李斯特菌按照二級采樣方法取樣不得檢出（n=5，c=0，m=0）。
四、李斯特菌主要檢驗方法
目前，食品微生物檢測體系主要包括，中國的國家標(biāo)準(zhǔn)（GB4789）和檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN）、國際化標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）方法、美國食品藥品監(jiān)督局（FDA）、美國農(nóng)業(yè)部（USDA）、美國官方分析化學(xué)師協(xié)會（AOAC）、加拿大健康保護部（MFLP）、歐盟食品安全局(EFSA)等檢測體系。
食品中單增李斯特菌(Li. monocytogenes)的傳統(tǒng)檢測方法主要包括增菌、分離和鑒定3個環(huán)節(jié)。目前，分離環(huán)節(jié)常會采用顯色培養(yǎng)基，使其菌落顏色不同于其它干擾菌，實現(xiàn)快速分離。鑒定常采用生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)。目前，生化反應(yīng)的鑒定技術(shù)多采用數(shù)值分類鑒定和自動化檢測技術(shù)。
五、李斯特菌快速檢測技術(shù)
傳統(tǒng)方法檢測費時費力操作要求高，因此，李斯特菌快速檢測技術(shù)和產(chǎn)品的開發(fā)是必要的。美國、歐盟等發(fā)達國家對微生物快速檢測方法的研究和產(chǎn)品認(rèn)證體系相對成熟，各種不同的快檢系統(tǒng)和自動化儀器被推出，并得到廣泛的應(yīng)用。當(dāng)前，李斯特菌快速檢測方法為增菌以后，生化鑒定之前，對樣本進行快速篩選，以縮小檢測范圍，減少檢測任務(wù)，提高檢測效率�？焖贆z測方法主要包括酶底物顯色技術(shù)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測三大類。
1、即用培養(yǎng)技術(shù)
即用培養(yǎng)基技術(shù)則省掉了前期準(zhǔn)備工作，可以直接檢測樣品，從而節(jié)約了大量人力成本。目前，商業(yè)化的固定培養(yǎng)基技術(shù)主要有兩種：紙片法和即用平皿法。紙片法是指將顯色培養(yǎng)基固定于紙片上，上方再蓋一層帶有方格的透明薄膜，以方便計數(shù)。即用平皿法是指用已倒有培養(yǎng)基的平皿，接種操作與傳統(tǒng)涂板、劃線法一樣。其優(yōu)點和紙片法一樣，即省掉了前期準(zhǔn)備工作，可以直接接種培養(yǎng)。此類產(chǎn)品主要有3M的Petrifilm試紙片、 良潤生物的MicroFast®測試片、北京陸橋的Easytest 系列產(chǎn)品及綠洲生化的微生物測試片等，已被許多研究被證明與傳統(tǒng)方法的檢測結(jié)果無顯著性差別。
2、免疫學(xué)檢測法
該技術(shù)以抗原抗體免疫為基礎(chǔ)，制備特異性克隆抗體檢測細菌。目前國內(nèi)外李斯特菌快速檢測的此類技術(shù)主要包括：酶聯(lián)熒光分析法(ELFA)、金標(biāo)免疫層析技術(shù)、流式細胞技術(shù)等。ELFA 靈敏度比ELISA 高，并省去了ELISA 中的顏色反應(yīng)，縮短反應(yīng)時間；但缺點是成本較高，目前主要應(yīng)用在自動酶聯(lián)熒光免疫檢測系統(tǒng)(VIDAS)上。金標(biāo)免疫層析技術(shù)是將高度特異性抗單增李斯特菌抗原的抗體束縛在色原載體上，且可與固相支撐基質(zhì)相分離。當(dāng)檢測樣品中存在李斯特菌時，測試單元的試劑將會被展開，產(chǎn)生肉眼可見的確定性反應(yīng)。流式細胞術(shù)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)。該檢測技術(shù)平均1min 即可得到檢測結(jié)果，無需培養(yǎng)和樣品制備，靈敏度可以達到1～100CFU，但儀器投入較大，檢測成本相對較高，對樣本的要求高，嚴(yán)重的制約這該技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用。
3、分子學(xué)檢測方法
主要包括核酸探針雜交技術(shù)、PCR 檢測技術(shù)等。DNA 探針法是將2 條堿基互補的DNA 鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下雜交，通過檢測樣品與標(biāo)記性DNA 探針之間形成的雜交分子來檢測樣品中的單增李斯特菌，測定放射性或熒光強度即可得出樣品中單增李斯特菌的個數(shù)。PCR 是近年來廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)檢測方法，在單增李斯特菌的檢測中以其遺傳物質(zhì)高度保守的核酸序列（常用的靶序列包括hly、actA、prfA等）設(shè)計引物進行擴增。該方法特異性好，但靈敏度低，對樣品進行前處理后再進行擴增，可以提高檢出率和檢測靈敏度。國內(nèi)外目前主要應(yīng)用的PCR技術(shù)包括：實時熒光PCR(Real-timePCR)、多重PCR、恒溫擴增、RT-PCR 方法、IMS-PCR檢測技術(shù)等。
4、增菌快速檢測技術(shù)
不管是國標(biāo)GB方法還是ISO、FDA等方法，李斯特菌檢測必須經(jīng)過2次增菌后再進行分離鑒定，操作比較繁瑣，操作過程容易造成污染，且耗時較長。MicroFast®李斯特菌快速增菌培養(yǎng)基為一步增菌培養(yǎng)基，即在檢測擴增李斯特菌的過程中不需要二步增菌，因此操作性更方便。
具有如下優(yōu)點：
（1）對培養(yǎng)基進行增菌檢測
在450個食品樣本中添加一定量李斯特菌，建立感染模型，分別用FM快速增菌培養(yǎng)基和國標(biāo)法規(guī)定對培養(yǎng)基進行增菌檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FM培養(yǎng)基對李斯特菌復(fù)蘇效果顯著，尤其是檢測冰激凌、奶酪類產(chǎn)品，具體對比如表2所示。
（2）擴增速度更快速
通過實驗間比對李斯特菌在四種不同培養(yǎng)基中的生長速度，發(fā)現(xiàn)李斯特菌在MicroFast®培養(yǎng)基（以下稱MF）中具有最快的生長速度。
（3）具有更強的選擇特異性
通過實驗測試，該培養(yǎng)基可以抑制絕大多干擾菌的生長（1/115，即115株非李斯特菌種僅有1株能夠生長）。
六、小結(jié)
微生物檢測包括前處理、增菌、富集、檢測等環(huán)節(jié)。為實現(xiàn)快速、實時、準(zhǔn)確的監(jiān)測食品微生物，每個環(huán)節(jié)都應(yīng)有相應(yīng)的篩查技術(shù)及產(chǎn)品。我國在微生物快速檢測技術(shù)的應(yīng)用及技術(shù)研發(fā)方面相對歐洲國家比較落后，快速檢測技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用需要政府相關(guān)機構(gòu)、科研單位、企業(yè)共同的努力建立一套快速、準(zhǔn)確、簡單的檢測體系，此外，還需要降低檢測成本，提供檢測靈敏度和實用性，這些是今后微生物快速檢測的發(fā)展趨勢。
（內(nèi)容來源實驗與分析）
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